處理及冷凍保存用來作臨床移植的臍帶造血幹細胞之最佳時機

處理及冷凍保存用來作臨床移植的臍帶造血母細胞之最佳時機

Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord haematopoitic stem cells for clinical transplantation

Bone Marrow Transplantation 23, 131-136

AA Shlebak, SB Marley, IAG Roberts, RJ Davidson, JM Goldman and MY Gordon

顏秀如

一、背景

自1988年實施第一例臍帶血造血母細胞移植以來，全世界已經實施超過500例臍帶血造血母細胞移植。現在我們已可由骨髓及活動的周邊血液取得足夠的造血母細胞來達成安全又快速的移植, 但仍無法由臍帶血取得由足夠的造血母細胞; 又近來的研究顯示, 臍帶血移植的臨床結果與每公斤輸入的有核細胞的數目有關.根據以往的研究可知道以下因素可能會影響用來移植的臍帶血中的造血前源細胞; 我們想深入研究這些因素對臍帶血中的造血先驅細胞之生存率及品質的影響為何.

À 取得位置

Á 在收集後儲存多久才處理

Â 冷凍保存

二、方法

1.臍帶血的收集與分離

À 在正常的足月生產後由臍靜脈或胎盤底部的靜脈取得臍帶血 ,經以下的過程處理之. (使用3%的醋酸融解紅血球, 計數, 稀釋, 離心, 再清洗三次, 重新懸浮之, 加入15%牛胎兒血清, 裝於內含肝素的容器中).

Á 除非特別說明, 此處理過程一般需於收集後2-4小時內處理完畢.

2.冷凍保存

À 冷凍:

已分離的單核細胞(MNCs), 經10%DMSO及自體血清處理後, 再以下面兩種方式冷凍之:

被動冷卻法：將細胞先置於-70℃過一夜,隔天再放入液態氮中.

控制速率的冷凍法：以programmed freezer逐步降溫，來冷卻細胞.

Á 解凍:

冷凍保存後的單核細胞(MNCs), 以40 ⁰C水浴的方式來快速解凍, 之後再以含HBSS的溶液清洗, 並加入15%牛胎兒血清. 肝素. DNAse, 再去計算全部的有核細胞(TNCs)及單核細胞(MNCs)的數目. 細胞生命力是以錐藍排除法(trypan blue exclusion)來估計.

3.集落生成的分析：包括CFU-GM及BFU-E.

三、結果

1.取樣的位置

À 在不同的取樣位置(臍靜脈或胎盤底部的靜脈), 以成對的樣本收集相同的體積, 分析樣本內之

發現兩者之間的差別不大.

Á 不同的取樣位置其產生次級集落的能力差別也不大.

2.儲存時間與處理時機的影響

À 以25⁰C儲存, 在0. 6. 9. 12. 24小時後, 使用Ficoll分離法.

在超過9小時的儲存下, CFU-GM數目明顯的減少(2.0→0.78×10³/ml).

儲存時間大於6小時以上, CFU-GM的數目有明顯的減少.

而MNC在儲存時間6小時以上, 其數目減少的並不如CFU-GM多.

即在過久的儲存下,造血目細胞會有選擇性的減少.

Á 以4⁰C儲存, 在0. 9小時後使用Ficoll分離法.

儲存時間大於9小時以上, 集落生成單位(CFU-GM)的數目亦開始急速減少.

無論在4⁰C 或室溫下儲存超過9個小時以上, 造血母細胞的數目就會急速減少.

3.冷凍保存的影響

À 成對的臍帶血樣本分別以被動冷卻法或控制速率的冷凍法冷凍, 在MNC的回復. 生命力及CFU-GM的存活率上, 兩者差別不大.(見表一)

Á 我們發現有經冷凍保存與未經冷凍保存的臍帶血之CFU-GM的品質, (以其產生次級集落的能力作評估), 兩者的差別在統計學上是有意義的.(104 vs 136, P=0.04)

四、討論

1.不同的取樣位置(臍靜脈或胎盤底部的靜脈), 在造血母細胞的含量及產生次級集落的能力上差別不大.

2.在收集臍帶血後, 早點處理及冷凍保存是很重要的. 最好在收集後6小時內處理完畢, 最慢也要在9小時之內完成.

3.冷凍保存的方式(被動冷卻法或控制速率的冷凍法)在MNCs的生命力及CFU-GM的回復率沒有差別, 所以我們可以利用現有的資源來作臍帶血銀行的冷凍保存.

4.冷凍保存會影響臍帶血中CFU-GM產生次級集落的能力.

5.我們可測量造血母細胞的質與量來評估臍帶血的收集物.

表一比較兩種不同的冷凍方式

結果	被動冷卻法中數(範圍)(%)	控制速率冷凍法中數(範圍)(%) 〔P值〕
MNC回復率	90(88-100)	97(92-100) 〔0.07〕
MNC 生命力	91(70-93)	93(90-95) 〔0.14〕
CFU-CM 存活率	78(47-86)	74(60-100) 〔0.5〕